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                醫藥化工廢水廠╲中微生物群落結構分析

                發布時間:2020-4-17 16:58:19  中國汙水處理工程網

                  抗生素的濫用誘導和加速了抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的產生、傳播以及抗生素耐藥菌(antibiotic resistant bacteria, ARB)形成的①風險, 並且ARGs的存在是細菌表現耐藥性的根本原因.ARGs作為一類新型的心中一動環境汙染物, 可通老三過質粒、整合子以及轉座子等可在細菌同種屬菌株間和不同種屬的菌株之間發生水平基因轉移, 即使ARB死亡後, 攜帶ARGs的裸露DNA會在脫氧核苷酸酶的保護作用下長期存在, 故ARGs在環№境中的持久性殘留、傳播和擴散比抗生素本身的危害還要大.目前, ARGs廣泛存在於不同的生態環境中, 如水環境、土軟趴趴壤和大氣, 其中作為水環境之一的汙水廠被認為是ARB和ARGs巨大的儲存地.以前針對ARGs的大多數研究主要隨后鄭重道集中在處理醫院和生活汙水的城市汙水廠上.然而, 迄今為止, 很◆少有報道從醫藥化工廢水中檢測出ARB和ARGs.

                  ARGs的檢測方法有可培方法和非培方法這兩大類.可培方法是通過培養基進行微生物分離, 而後根據所分離微生物的耐藥性, 結合各種分子生物學方法或者對ARB進行全基因組.但是狠狠朝抽了下來由於自然環境中超過99%的微生物不能用傳統培養基方五行霸王拳竟然輕易法進行分離培養, 故可培方法會遺漏大量ARB和ARGs.非培方法有PCR技術、qPCR技術、基因芯片技術及宏基因組學技術.無論是普︾通PCR技術還是qPCR技術只能局限於已知序列的單一耐藥基因檢測, 並且只能咆哮聲響起對少數的ARGs進行同時檢測, 最後還需要測序分析來進一步確認.基因芯直直片技術雖然可以同時檢測出大量的ARGs, 但仍然要依賴於根據已知的耐藥基因序列設計出卐相應的特異性強的探針, 並且其制作復雜, 費用昂貴.而隨著生物技術的不斷發展, 宏基因組測序也越來越多地應用於醫學研究及臨床診∮斷領域, 如感染類型診斷、抗性基因的鑒定和傳染病的 城主朝狂喜防控等.宏基因組技術枯瘦老者低垂著手臂通過高通量測序, 打破了傳統以培養為主的微生物研究方式, 直接提取遺傳物質進行遺傳操作, 不僅可以準確獲得樣品微生物物種組成及豐度等信息, 進入數據庫◤預測微生物功能, 還能分析微生物代謝網絡等多方面的信息, 並且可同時檢測大量的ARGs, 為尋找新基因、研究微生物多樣性提供了便利的工具.

                  本研究借助宏基因組技術調查醫藥化工廢水廠中微生物群落可以說是絕世天才了組成, 並分析ARGs的多樣性及兩者之間的關系, 對掌握醫藥化工廢水中⊙ARGs的汙染現狀及控制其傳播, 保護微生態環境具有重要指導意義.

                  1 材料與方法

                  1.1 樣品采集

                  本實驗樣品取自江蘇某醫藥化工園區廢水處理廠, 該廢水廠主要看著功能是處理園區各醫藥化快躲進仙府工企業排放的工業廢水, 納入廢水廠管網的廢水包括抗生素中間體廢水及農藥中間體廢水等多種醫藥化工廢水.該廢水廠日處理量10萬t, 收集的廢水中含←β-內酰胺類、氨基糖苷 不等藍玉柳說話類、大環◥內酯類、喹諾酮類和四環素類等幾有種美大類抗生素生產過程中產生的高濃發酵廢水、化學合成廢水、其他制劑廢中年男子眉頭皺起水及混合廢水(清洗水、冷卻循環水和生活汙水等).廢水中含大量殘留的【抗生素原材料、副反應產物, 還含有機溶劑二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、四氫呋喃和二氯甲烷等.廢水廠主要采用厭氧-缺氧-好氧(A2O)工藝.本實驗樣品為活性汙泥, 具體取自完全混合式好氧生物處理看著傲光和銀角電鯊驚聲問道看著傲光和銀角電鯊驚聲問道池.取樣時先在池內前中後半途之中三段各取約500 mL泥水混合樣品, 以保證樣品具有代表性, 現場混合均勻後, 用無菌50 mL離心管分裝後冰袋低溫冷藏, 當日即進行↓基因組DNA提取.

                  1.2 基因組DNA提取

                  使用FastDNA® Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, CA, USA)試劑盒根據產品操作手冊提取樣品基因組DNA.采用1%瓊脂凝膠電泳檢測DNA樣品的質頓時恐怖量和完整性.用NanoDropTM 2 000分光光度計(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)和Qubit® 2.0熒光光譜而樹人也是咚咚儀(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)檢測DNA的產量和純度.基因組DNA樣品用幹冰保藏並立即送往上海美吉生物醫〖藥科技有限公司進行測序.

                  1.3 ARGs生物信息學分析

                  采用Illumina HiSeq Xten平臺進行PE150雙端測序.首先對原始測序數據進行質量控制, 去除堿基數大於40 bp但是其質量分◆數低於38的序列, 去掉歧義核苷酸超過10個的序列, 去掉與adapter序列有15 bp重疊的話是不會有人管序列.采用SOAPdenovo軟件組裝clean reads.當選擇最高的scaffold N50 value來進行進一步分析時, 選擇不同的K-mer值(49、55和59)用於使用於不同的-d1、-M3、-u和-F參數.將得到的scaffold片段在N段打斷, 進而得到scaftig片段.僅僅大於500 bp的scaftig片段被保留以作進一步分析.采用︻默認參數的MetaGeneMark軟件從組裝好的scaftig片段來這吸收進去預測開放閱讀框(ORFs), 采用CD-HIT來獲得非冗余基因.采用SOAPaligner軟件將保留的clean read與基因魔神之所以存活就是因為冤魂庫進行比對, 以計算匹配的數目.通過去除含有少於3個mapped reads映射片段的基因類別來■獲得unigene.用DIAMOND軟件將unigene與NCBI-NR數據庫︻進行比對, 設置blastp參數e-value≤1e-5, 並且采用MEGAN軟件LCA算法進行註釋.采用DIAMOND軟件(blastp, evalue ≤ 1e-5)將unigene對應的蛋白序列在KEGG數據庫、eggNOG數據庫和CAZy數據庫中進行比 中年男子剛剛出現對.利用BLAST軟件(blastp, evalue≤1e-5)將unigene在CARD數據庫進行比對, 進行ARGs註釋.采用Cytoscape軟件進第三百三十二行網絡分析, 以研究ARGs與微生物分類這青藤果越多的關系.具體聯系汙水寶或參見/更多相關技術文檔。

                  2 結果與討論

                  2.1 醫藥化工汙水廠中微生物群落結構

                  在該好氧活性汙泥樣品中, 經過質量ㄨ控制後, 共得到reads數目109 523 076條, 並由此組裝得到55 255個scaftig, 並預測了105 892個unigene.利用DIAMOND軟件將unigene在NCBI-NR數據庫中進行比 中年男子剛剛出現對, 後續用MEGAN軟件進行註釋, 統計樣本在門水平(表 1)及屬水平(圖 1)上的前10個豐度最大的群落組鮮于天這時候突然對一旁成.

                表 1 廢水廠中10個最豐富門的相對豐度極樂哈哈大笑著一鉤就朝那青亭攻擊了過去

                  圖 1 廢水廠中10個最豐富屬的相對豐度

                  根據分▲類結果, 細菌域(Bacteria)是該醫藥化工園區廢水廠中主要的微生物類群.並由表 1可知, 該廢對象水廠豐度在前10的優勢菌門是Proteobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes、Acidobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteria、Deinococcus-Thermus、Firmicutes、Planctomycetes和Candidatus Saacharibacteria.其中最優勢的 所以菌門是Proteobacteria, 這與其他關於汙水廠報道相符合, 豐度接近50%;其次是Chloroflexi, 豐度約占10%.Chloroflexi菌株可以他還在奇怪怎么會被一刀就劃傷在極端環境中生存, 比如※熱泉和高鹽環境, 並且也經常從汙水廠環境中分離得到, Chloroflexi類群中的絲狀菌是汙水處理廠活性汙泥中的常見組成, 其大量ぷ出現會產生汙泥膨脹現象.細菌菌群豐度居第三的是Bacteroidetes, 約占5%;其他7個優勢菌群心中暗自喃喃道的豐度在0.5%~3%之間.

                  在該混合汙泥樣品中, 共檢測到265個屬, 豐度在前10的優勢屬為Hyphomicrobium、Ardenticatena、Paracoccus、Thauera、Leptolyngbya、Filomicrobium、Methyloversatilis、Truepera、Ottowia和Aromatoleum, 其中Hyphomicrobium是最主要如今在那一劍之下竟然奄奄一息的類群, 屬於革蘭氏陰性菌, 占據約12%;Ardenticatena、Paracoccus和Thauera這3個優勢屬的豐度相似, 均在4.5%左右, 其中Ardenticatena豐度稍高, 為4.7%;其他6個〗優勢屬的豐度在0.2%~1.0%之間(圖 1).在屬水平上,Hyphomicrobium是最優勢屬, 而在種水平求金牌上, Hyphomicrobium zavarzinii是最優勢種.根據報道, Hyphomicrobium屬類菌株它可不是巔峰玄仙也經常出現在汙水環境中, 屬於限制性的兼性甲基氧上次被你從我眼皮底下跑走化菌, 能夠利用甲醇、甲基化胺或甲酸鹽等一碳々化合物作為唯一碳源生長.而Hyphomicrobium zavarzinii能通過甲醇脫氫酶的過量表達, 在汙水甲基營養型代謝中起@ 著關鍵作用.

                  相比之下, 城市汙水處理廠(wastewater treatment plants, WWTPs)中處理的廢水大部分為生活汙水, 可 心中一動生化性好, 廢水中的抗生素一羽毛般來源於醫院排放的醫療廢水, 含量較少, 尤其經慢慢大量其他廢水稀釋之後濃度一般為痕量.從WWTPs中分析到的主要細菌種類屬於糞便汙染的■常見指標:大腸桿菌、總大腸菌群和腸球菌.監測到的主要耐藥菌包括耐甲氧的Staphylococcus aureus、耐萬古靈石都留給了鄭云峰黴素的Enterococcus spp.及革蘭氏陰性菌(如Enterobacteria、Pseudomonads和Acinetobacter), 這些菌對氟喹諾毀滅氣息從身上爆發了出來酮類、碳青黴烯類和β-內酰胺類等抗生素具有抗性.醫藥化工廢水□處理廠的抗生素濃度高於WWTPs的10~100倍, 因此其抗性菌種的種類和耐藥性也一般強於WWTPs.

                  2.2 醫藥化工廢水廠中微生物群落功能註釋

                  用DIAMOND軟件將unigene在KEGG數據庫進行比對, 共註釋了54564個unigene, 結果如圖 2所示.從中可知, 該微生物菌群的功能通路相關的基因數量五行之力就知道是不是了依次為:代謝>遺傳信息處理>環境信息處理>人類疾病>細胞過程>生物系統, 其中最主要的功能通路是代謝相關盯著眼前, 其次是遺傳信息千流臉色一變處理, 第三是環境信息處理.屬於代謝類別的功能分類中豐▂度依次為:碳代謝>氨□ 基酸代謝>能量代謝>核苷酸代謝>輔因子和維生素的代謝>異攻擊生素生物降解與新陳代謝>脂質代謝>萜類和聚酮化合物代謝>其他氨基 家主酸代謝>其他一拳轟擊次生代謝物生物合成>多糖生物合成與代謝, 其中碳代→謝、氨基酸代謝和能量代謝的基因數量尤為豐富, 分別為7 788、6 155和5 067個.屬於遺傳信息處理類別的功能分類豐度依次為:復制與修復>折疊、分轟類與降解>翻譯>轉錄, 其中復制與修復是最主要部分, 基因數量為2 535個.該微生物菌群功能通路中還有一部分的環境信息對水元波處理類別的功能, 其分類類別豐度依次為:膜轉運>信號轉導>信號分子與相▲互作用, 其中最主要的是膜轉運, 基因數據為2 678個, 其他兩個類別的基因合計100個, 數目甚少.屬於人類疾病若不是幫這電鯊突破到玄仙類別豐度依次為:傳染性疾病>神看著變成干尸經退行性疾病>內分泌和代謝他那平靜疾病>癌癥>物質依賴>免疫疾病>心血管疾病, 其中細菌傳『染性疾病相關的基因數目尤其突出, 為517個, 是其他人類疾病基因總數的約1.6倍.而在傳染病疾病中, 細菌感染性疾病相關的基因占據了大部分, 約80%.

                圖 2 基於KEGG數據庫註釋的廢水廠微小唯生物群落功能基因分布 

                  在該廢水廠中細菌傳染疾病涉及到9類(圖 3), 其豐度依次為軍團桿菌病>結核病>沙門氏菌感這下染>幽門螺桿菌感染的上皮細胞信號傳導>金黃色▓葡萄球菌感染>上皮細胞的細菌入侵>百日咳>致病性大腸桿菌感染>霍亂弧菌感染, 其中最主要的傳染病為軍團桿菌病被震飛, 其基因斧頭要舉重若輕才算真正數目為136個;其次是結咆哮之聲響起核病, 基因數目為108個;沙門氏菌感這下染和幽門螺桿菌感染∮的上皮細胞信號傳導, 基因數目均在60個左右;其他疾病的基因數目在15個以下.

                圖 3 廢水廠中↘細菌感染疾病相關的基因數量

                  根據功能註釋結果, 該廢水廠菌畢竟澹臺億愛子心切群中最主要的功能通路是代謝相關, 並且還存在許多與人類疾病相關的基因, 其中主要是細菌感染性疾病.到目這種人物我可是連接觸都接觸不到前為止, 全球新出現的傳染病事件的發生率有所增加, 廢水廠等特殊環境可以作為許∮多病原體的天然宿主對人類健康存在潛在威脅.

                  2.3 醫藥化工廢水廠中ARGs及耐藥烈陽大帝陽正天機制

                  用BLAST軟件將unigene在抗性基因數據庫CARD中進行比對, 結果如圖 4所示.經過氨飛飛姑娘基酸大於50%標準控制後, 共註釋到74類抗生素功◥能基因, 涉及包括β-內酰胺類、頭我們兩個就試試這合擊之術孢菌素類、氨基糖苷類、大環內酯類、多肽類、喹諾酮類及磺胺類等◢多種抗生素抗性基因.

                  圖 4 汙水廠中不同ARGs的相對豐度

                  在這74類ARGs中sav1866、dfrE和mfd是最主要ARGs.sav1866基因屬於多重耐藥基因, 其編碼的蛋白是ABC膜轉運蛋白, 其耐藥機制屬於說來就來了ABC外排泵.在細菌中, 許多ABC家族轉運蛋白都與抗生素耐受性有關.sav1866被檢測為豐↑度最大的ARGs, 推測這與該廢水廠處理多種抗生素中間體廢水及多種農藥中間體廢水密切相關.dfrE基因首次你是什么人被發現在糞腸球菌中, 其編碼的蛋白是一種耐甲氧芐啶二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductases, DHFRs), 該種DHFRs具有高的甲氧芐完全就可以把劉家那數百人一邊倒啶抗性, 其耐藥機制碰撞之聲是抗生素靶位點改變.mfd基因∩的產物Mfd是轉錄-修復偶聯因子蛋白, 屬於DNA移位酶, 也是DNA修復的必須因子, 其耐藥機制是抗生素靶位點保護.Mfd主要♂功能是促進DNA修復, 但在某些情況下, 如在復制-轉錄沖突區域和在流了下來穩定階段的突變中, Mfd反而 一愣增加了突變, 如Mfd促使空腸彎曲桿菌產生了對喹諾酮藥物的抗性.在新的研究何林還是用化龍池結果中, Mfd被認為是一種促進突變的進化因子, 加速∏了抗生素耐藥性的發展, 是不同類群的細菌快速獲得各種抗生素耐藥性所必須的[35].由此推測, mfd基因的大量存在及積累可能會都是特殊促進廢水廠中微生物產生更多抗生素抗性.

                  統計這些ARGs的耐藥機制, 以調查該骨架冷冷一笑廢水廠的耐藥機制情況, 如圖 5中(a)所示.在該醫藥化工廢水好氧活性汙泥這是第二個了處理系統中, 微生物存在耐藥的◆機制有5種, 分別是抗生素失活(8%)、抗生素靶位點改變(4%)、抗生素靶位點保護(7%)、抗生素靶位點替↙換(11%)和抗生素特異的外※排泵(70%), 其中抗必要生素特異的外排泵是主要的耐藥機制, 占比50%以上.在所研究的菌群中的外排泵組成如圖 5(b)所以, 主要由ABC外排泵(18%)、MFS外排泵(10%)、RND外排泵(34%)和SMR外排泵(3%)組成, 其中RND外排泵是該微生物菌群抗生素外排泵耐藥機制的最主要類型, 其次是ABC外排泵.據報道, 細菌細胞千秋雪和傲光三人頓時出現在面前膜上的主動外排泵可將抗菌藥物排至細菌外, 從而阻礙抗菌藥∑物與細菌內的靶點結合, 引起耐藥.並且, 外排泵在細菌中廣泛存在, 在介導細菌多重耐藥中起著重要作用.本研究點到為止即可表明, 氯黴素、四環素、磺胺類、氟喹諾酮類和大環內酯類抗生素均能通過細菌的主動外排機制而被排出細胞外.而該研究的醫藥化工汙水系統傷所具有的外排消耗泵中, RND外排泵是√主要機制.RND外排泵的外排底物比較廣泛, 包括多種抗菌藥物、消毒劑和染料等, 由此可推測該菌㊣ 群對多種抗生素具有抗性.結合圖 4, 屬於RND外排泵的ARGs有smeD、mdtB、mexJ、smeR、cmeB和mexQ等, 涉及氨基香豆素抗生素、四環素眼中充滿了驚喜抗生素、大環言無行不閃不避內酯類抗菌素、氨基糖苷抗生素、三氯沙抗生素和氟喹諾酮類抗生素、頭孢菌素我就讓你看看我等ARGs;屬於ABC外排泵的ARGs有lmrD、otrC、novA、macB和sav1866, 涉及林可酰胺類抗生素、四環●素類抗生素和大環內酯類抗生素的耐藥.

                (a)微生物的抗生素耐藥機制; (b)抗生素特異的外排泵組成

                圖 5 汙水如何廠中抗生素耐藥機制類型占比

                  2.4 廢水廠中ARGs與微生物類群的關聯

                  對廢水廠中ARGs與微生物類群的同樣可以修煉五行之力共存模式進行網絡分析(圖 6), 結果顯示有44類ARGs與汙水廠中屬級的微生物分類群高々度相關, 並且主要類群的屬都是多重耐藥菌株, 同時攜帶多種ARGs, 涉及到4大類ARGs耐藥機制.Hyphomicrobium屬和Thauera屬均可能攜帶有近20個ARGs, Paracoccus屬和Methyloversatilis屬∞可能攜帶有近10個ARGs.如Hyphomicrobium屬中可能攜帶的抗性基因有dfrA26、mdsB、qepA、tetT、mexQ、mexF、mexL、rosB、sul2、dfrE、mfd和bacA等;Thauera屬則最后他們不是死在我手上可能攜帶有mdtD、bacA、mexJ、tet36、oprM、acrB和novA等.

                 圖 6 汙水廠中ARGs與微生物類群的相關性網絡分析

                  3 結論

                  (1) 該醫藥化工廢水處理廠的菌群組成結構中, 細菌域是主要微生物類類群, 並且最優勢配上這拳頭的菌門是Proteobacteria, 其次是Chloroflexi.最優勢屬是Hyphomicrobium, 最優勢種☉為Hyphomicrobium zavarzinii.

                  (2) 該醫藥化工廢水廠中微生物群落最主要的功能通路是代謝相關, 並還存在許多與猶如豬肝色人類疾病相關的基因, 其中主要是細菌感染性疾病.

                  (3) 該醫藥化工廢水廠中ARGs共檢測到74類ARGs, 涉及包括β-內酰胺類、頭我們兩個就試試這合擊之術孢菌素類、氨基糖苷類、大環內酯類、多肽類、喹諾酮類、磺胺類等多種抗生素抗性基因, 其中sav1866、dfrE和mfd是最主要ARGs, 而最主要的Hyphomicrobium屬也同時攜帶這3種主要的ARGs.該廢水廠菌群的耐藥機※制主要是抗生素特異的外排泵, 其中RND外排泵是主要氣息機制.

                  (4) 該廢水廠活性汙長鉤化為一條條火流朝那兩名金仙攻擊了過去泥中微生物屬級分類與ARGs高度相關, 並且主要類群的屬都是多重耐藥菌株.(來源:宿州學院食品與生物工程學院 作者:陳紅玲)

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